Radioimmunotest

De techniek van radioimmunoassay, algemeen bekend als RIA Engels Radio Immuno Assay, een laboratoriumtechniek gebruikt om immunogene verbinding in zuivere vorm en radioactief merkbare dosis. Het heeft een hoge gevoeligheid, hoge specificiteit, hoge nauwkeurigheid.

Het presenteert nadelen zoals de hoge kosten voor apparatuur en reagentia, de duur van de reagentia en radiologische gevaren bij het gebruik van radioactieve reagentia.

Zijn uitvinding leverde hem de 1977 Nobelprijs voor Geneeskunde voor Rosalyn Yalow.

Toepassingen

De techniek van radioimmunoassay gemeenschappelijk in verschillende klinische settings: de diagnose van diabetes, hoge bloeddruk, aandoeningen van de schildklier en groeihormoon in het bloed dosering van geneesmiddelen of forensische toepassingen.

Werkwijze

De belangrijkste elementen van de test zijn: de specifieke antilichaam aan het antigeen te bepalen, het monster dat de Ag en de Ag radioactief gemerkte in zuivere vorm.

Er zijn 3 soorten RIA:

Dosering voor concurrentie binding of verdringing

Het voert een eerste reactie voor de vorming van het complex Ag * Ab:

* Ag + Ab & gt; Ag * Ab

Het voert dan de tweede reactie verplaatsing van het antigeen gebruikmakend gemerkt antigeen als "koude" hetzelfde monster te meten:

Ag + ag * Ab & gt; Ag * Ab + Agab

Dosering balans

Het is de meest voorkomende vorm. In dit geval gemerkt antigeen en ongemerkte gelijktijdig geïncubeerd.

Sequentiële dosering

Het voert eerst de reactie tussen overtollige antilichaam en niet gemerkt antigeen; dan verzadigen antilichaam sites met resterende vrije gemerkt antigeen.

Interpretatie van de resultaten en de kalibratiecurve

In alle methoden, hoe hoger de concentratie van niet-radioactief antigeen, hoe lager de hoeveelheid radioactief gemerkte antigeen gebonden aan antilichaam. Om dit interpreteren via een speciale ijkkromme verkregen door het toevoegen van bekende hoeveelheden van antigeen en groeien koud in het evenwichtsmengsel met gemerkt antigen. De curve vertoont een neerwaartse verloop van de gebonden fractie met toenemende concentratie van het antigen "koude". De waarde van de curve wordt vervolgens afgetrokken van een "witte" dat niet-specifieke binding van het radioactieve gehalte van de gebonden fractie. De waarde van de concentratie van antigeen in het te meten monster wordt verkregen door interpolatie van de waarde van de gemeten radioactiviteit deze curve.

De aanwezigheid van een "wit" in de gebonden fractie ondergeschikt aan verschillende factoren:

  • niet perfect scheiding tussen gebonden fractie en gratis voor mechanische beknelling door de laatste in het eerste. Wassen van het precipitaat deze fout wordt gereduceerd.
  • adsorptie van het radioactieve isotoop aan de wanden van de buis.
  • chemisch-fysische eigenschappen vergelijkbaar fractie tussen vrije en gebonden.
  • aanwezigheid van vreemde stoffen vervuilen gemarkeerd.
  • onnauwkeurige scheiding van de twee fracties.

De maximale bindingscapaciteit is gelijk aan de hoeveelheid gelabeld antigen gebonden in afwezigheid van antigen "koude". Meestal doseringen in het bereik van waarden, waarbij het onderzoek is evalueerbaar ligt tussen 25% en 75% van deze waarde. Het telt verband met concentraties buiten dit bereik kan niet worden beoordeeld als sterk beïnvloed door de zaak. Een te hoge kon niet goed binden aan het antilichaam en lage waarden kan moeilijk te detecteren.

Werkwijzen voor scheiding van de gebonden fractie

De werkwijze ideale scheiding betekent "net" bij het scheiden van de twee fasen, eenvoudig, niet duur, snel, niet interfereren met de antigeen-antilichaamreactie en niet beïnvloed door vreemde substanties. Nr werkwijze voldoet aan al deze eisen, maar er zijn nog verschillende alternatieven; Naast de scheiding door chromatografie over een kolom die zeldzamer.

precipitatie van immune complexen met zouten en / of oplosmiddelen

Deze stoffen maken het onoplosbare antigeen-antistof complexen indien toegevoegd aan het reactiemengsel "verplaatsen" met de watermoleculen van solvatatie van dergelijke complexen. De te gebruiken hoeveelheid van deze stoffen is afhankelijk van de samenstelling van de omgeving waarin zij optreden en wordt bepaald door middel van speciale curven gemaakt met mengsels van toenemende stof afscheider met of zonder antilichaam. U kunt ook gebruik maken van een centrifuge om het proces te versnellen. De hoeveelheid toegevoegde stof wordt dan gekozen om zo selectief mogelijk scheiden van de twee fasen. De werkwijze is eenvoudig en economisch, maar heeft nadelen zoals het feit dat ze niet specifiek en wordt alleen beïnvloed door variabelen zoals pH, temperatuur en concentratie van de verschillende componenten van het reactiemengsel.

immunoprecipitatie met behulp van tweede antilichaam

Het bestaat uit het precipiteren van het antigeen-antilichaamcomplex te worden gedetecteerd door de toevoeging van een voldoende hoeveelheid antilichamen gericht tegen een dergelijk complex. U kunt een pre-neerslag, is een post-neerslag. De eerste techniek heeft een voordeel vanwege het feit dat de neerslag dell'immunocomplesso niet wordt beïnvloed door vreemde stoffen in het serum van de patiënt, maar is echter minder storingsgevoelig dan de tweede van het tweede antilichaam in de agglutinatiereactie van het antigeen en vereist een grotere hoeveelheid van het antilichaam zelf. Deze methode heeft voordelen zoals het specifiek bruikbaar is in vele reacties RIA evenals geheel onafhankelijk van omgevingsfactoren zoals pH en temperatuur. Heeft nadelen zoals de kosten en complexiteit verder de mogelijkheid van kruisreactie van het tweede antilichaam met het serum Ig en meer tijd om het resultaat te verkrijgen

niet-specifieke adsorptie van het antigeen

De steenkool en steenkool-dextran kan worden gebruikt bij de scheiding van de gebonden fractie als de twee fracties maat en elektrische lading geheel anders dan de adsorptie van moleculen van grotere grootte en lading op zijn oppervlak de voorkeur boven die kleine en weinig lading. Deze methode is daarom niet geschikt bij reacties waarbij antigenen zijn grote moleculen reeds op zichzelf of als het virussen. Centrifugeren ook in dit geval kan het proces versnellen. Andere adsorptiemiddelen gebruikte ionenuitwisselende harsen, silica, hydroxyapatiet en talk. De optimale concentratie van steenkool voor gebruik in de reacties is ook hier bepaald door middel van speciale curven uitgevoerd op monsters met een zonder antilichaam tegen toenemende doses van de afscheider. Deze techniek heeft de voordelen van die een enkele passage, snel, goedkoop en reproduceerbaar te zijn. Het wordt alleen gebruikt in de assay van haptenen en kleine moleculen voor de eerder beschreven functies. Heeft als nadelen het feit dat variaties in eiwitconcentratie, pH, ionsterkte, reactietijd en temperatuur beïnvloeden ze de scheiding en de mogelijkheid van bepaalde antigenen te dall'immunocomplesso, Ig species los met lagere affiniteit.

adsorptie van het antilichaam op de vaste fase

De antilichamen zijn gemaakt om zich te houden aan de vaste fase te verlaten in contact met het voor een paar uur en daarna wassen. De contactplaats dient uiteraard niet interfereren met de antigeen-antilichaamreactie en de reactie plaatsvindt tussen RIA gemerkt antigeen en die niet concurreren voor antilichamen plaatsen vrij. Het toetredingsproces, dat plaatsvindt via hydrofobe obligaties wordt alleen beïnvloed door de pH, ionische sterkte, de contacttijd en de concentratie van Ig in oplossing. U kunt ook gebruik maken van glutaaraldehyde in sommige gevallen stabieler de band te maken in de buizen en deze moeten bij 4 ° C worden bewaard Naast de plastic wand van de buizen, kan de Ig ook houden aan Sepharose korrels, schijven papier, glas of geactiveerde cellulose met cyanogeenbromide of gemagnetiseerde deeltjes met magnetiet waarmee door middel van een geschikt magnetisch veld hun scheiding van de vrije fractie. Een andere techniek bestaat nell'adsorbire een tweede antilichaam aan de buizen waarop voeg de primaire voor de reactie; Dit verhoogt de beschikbare plaatsen voor antigen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is de gemakkelijke scheiding van de twee fracties. De nadelen zijn de behoefte aan grotere hoeveelheden van antilichaam en de complexiteit van de adsorptie reacties, naast het feit dat de procedure beperkt de contactplaatsen voor het antigeen. Bovendien, de kinetiek van de antilichaamreactie langzamer omdat de antigenen noodzakelijkerwijs in contact met de vaste fase reageren moet komen.

scheiding door proteïne A

Proteïne A is een stof die door Staphylococcus aureus kan het Fc-gedeelte van IgG zoogdieren binden. Het kan daarom gebruikt worden als een alternatief voor een dubbele antilichaam RIA assay. De scheidingsmethode snel is, is het niet een incubatieperiode vereist en voldoende centrigurare de buis de twee fasen scheiden.

(0)
(0)
Commentaren - 0
Geen reacties

Voeg een Commentaar

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Tekens over: 3000
captcha