Transgenese

Definitie

Uitgaande van de definitie van het transgen dat een vreemd gen ingebracht in een organisme door genetische manipulatie operaties, vandaag bedoelen we met de term transgenese de insertie van een exogeen gen in het genoom van een doelorganisme die als gastheer; Vandaar het transgen tot expressie wordt gebracht en wordt daarna doorgegeven aan nageslacht. De transgene organismen worden vaak aangeduid als genetisch gemodificeerde organismen: de twee termen zijn niet synoniem omdat de term transgenese heeft betrekking op het inbrengen in het genoom van een bepaald organisme genen van een organisme van een andere soort. Zijn gedefinieerd GGO ook die organismen die resulteren uit modificaties die niet voorzien in de insertie van elk gen, alsook organismen waarin het genetisch materiaal ingebracht afkomstig uit een organisme "donor" van dezelfde soort. In dit laatste geval, sommige geleerden spreken organismen cisgene ... Transgenese is een zeer bruikbare techniek voor de problemen van genexpressie en ontwikkeling van zoogdieren te bestuderen en om geldige dierlijke modelsystemen voor menselijke ziektes stellen. Een interessante toepassing is het gebruik van de melkklieren voor melkeiwitten belangrijk in de farmaceutische industrie te produceren. De melk is een lichaamsvloeistof, hernieuwbare, in grote hoeveelheden en je kunt vaak verzamelen zonder nadelige gevolgen voor het dier. Een nieuwe farmacologisch actief eiwit, aanwezig in de borstklier en uitgescheiden met de melk, niet ook secundaire effecten op de normale fysiologische processen van het transgene dier en dienen posttranslationele modificaties minstens volstrekt verenigbaar met die van de mens onderworpen. Uiteindelijk moet de zuivering van een eiwit uit melk, waarvan slechts een klein aantal verschillende eiwitten bevat relatief eenvoudig.

Een korte geschiedenis van het ontstaan ​​van transgenese

De oorsprong van transgenese terug tot het midden van de jaren '70. Het eerste experiment worden toegeschreven aan Rudolf Jaenish die met een micropipet geïnjecteerde DNA-fragmenten van SV40 in de coelomic holte van een muis embryo, demonstreren voor de eerste keer dat u zoogdieren mutanten krijgen. De muizen resultaten van dit experiment waren mutanten, maar ze konden worden beschouwd transgene. In 1980 een nieuwe groep van wetenschappers onder leiding van JW Gordon en F.H. Microinjecting recombinant DNA in de zygote aangetoond na de overdracht van het transgen naar nageslacht: ruddle voor een nieuw experiment gebouwd. De dieren verkregen, werden voor het eerst genoemd transgenen, en deze techniek wordt zelfs vandaag vaak getracht. In 1982 zagen we een nieuwe mijlpaal in de geschiedenis van transgenese. Wetenschappers R.D. Palmiter en R.I. Brinster microiniettarono bij muizen het groeihormoongen. Het experiment produceerde muizenstammen veel groter dan normaal, waaruit blijkt dat het mogelijk was om over te schakelen naar het genotype eveneens het fenotype.

Methoden van transgenese

Er zijn verschillende methoden van transgenese. De eenvoudigste is het gebruik van bacteriën en virussen als vectoren voor genoverdracht. Tegelijkertijd zijn alternatieve methoden ontwikkeld voor het exogene DNA in de gastheer te brengen: fysisch-chemische methoden, en receptor-gemedieerde endocytose. Meer complexe methoden, zoals gebruikt in de agrarische biotechnologie, met inbegrip van technieken biobalistiche en micro-injectie. Transgenese wordt gebruikt in genetische manipulatie voor de productie van heterologe eiwitten.

Transgenese omvat verschillende stappen:

  • De identificatie van het gen van belang;
  • De bouw van het transgen. Het gaat om de bouw van een nucleotide sequentie die omvat: de sequentie die codeert voor het eiwit van belang stroomopwaarts van een gen promotor en stroomafwaarts van een transcriptie terminator. De keuze van de promoter kan genexpressie, kan worden beperkt tot een lichaamsdeel of ontwikkelingsstadium sturen. In sommige gevallen de insertie van het transgen gebeurt door middel van een vector die kan omvatten sequenties die replicatie reguleren. Dragers bekendste zijn de plasmiden, kleine ringen van bacterieel DNA. De controlesequenties een promoter moet geschikt zijn voor het ontvangende organisme en selectiemerkers, die bijvoorbeeld kunnen genen voor resistentie tegen antibiotica of herbiciden omvatten.
  • De transformatie van de doelorganismen plaatsvindt door transfectie van het exogene DNA en dientengevolge de integratie van genetische informatie in de gastheercel. De introductie van het transgen of de vector in het genoom van de cel, kan worden bereikt met verschillende technieken zoals permeabilisatie van de membranen, mechanische procedures, invoering van biologische vectoren; Het is ook mogelijk het gen direct introduceren in de cel door micro-injectie.

Gebruik van plasmidevectoren

De feitelijke technieken gebruikt voor de overdracht van genen door de kiemlijn van zoogdieren vereist de integratie van exogeen DNA in een willekeurige plaats in het gastheergenoom. Echter, deze werkwijze ongewenste effecten hebben, zoals het zich niet goed kan positioneren in het gastheergenoom of breng schadelijke mutaties. Kunstmatige chromosomen van zoogdieren goede dragers voor de productie van transgenen, evenals voor de productie van cellulaire eiwitten en gentherapie toepassingen. Dit alles omdat ze het voordeel hebben:

  • hebben de mogelijkheid om grote DNA moleculen te voeren;
  • het vermogen om te repliceren in parallel met het gastheergenoom, maar niet geïntegreerd in;
  • hebben de mogelijkheid om te worden doorgegeven via de kiembaan.

De satelliet DNA-gebaseerde kunstmatige chromosomen: non-virale oorsprong van replicatie, telomeren en centromere. Transgenese en daaropvolgende controle op de aanwezigheid van de artificiële chromosoom omvat de volgende stappen:

  • SATAC isolatie, flowcytometrie, en vervolgens verzameld door centrifugatie.
  • Kweken van embryo's.
  • Het maken van een pronucleaire micro-injectie van SATAC in de rat, met behulp van borosilicaatglas micropipetten.
  • De totale winning van genomisch DNA en amplificatie door PCR om de aanwezigheid van hygromycine evalueren. Men gaat dan de kleuring van de B-galactosidase om de activiteit van het gen controleren lac Z.
  • Uitvoering van embryo's gekweekt op Colcemid, van in situ hybridisatie met fluorescerende DNA-probes satelliet, lac Z en HPH.

Opgemerkt wordt dat de kunstmatige chromosomen kunnen worden overgedragen tijdens mitose, de transgene nakomelingen van de persoon, zodat de overlevingskansen van een acceptabel percentage individuen. De creatie van transgene muizen met SATAC kunnen toepassingen in functionele genomica en het creëren van dierlijke modellen van menselijke ziekten.

Analyse van de expressie van het transgen

Na het transgen in het doel cel werd geïntroduceerd, moet men controleren of de juiste wijze in zijn nieuwe omgeving tot uitdrukking. Het is daarom aangewezen om de niveaus van de expressie van zijn RNA en eiwitten te analyseren. Het bepalen van de transcriptionele activiteit van het transgen kan worden gebruik gemaakt van verschillende technieken: Northern blot, RT PCR en in situ hybridisatie. In plaats van het analyseren van de expressie van het transgen op het niveau van translatie met behulp van Western blot en immunohistochemie. Variaties mogelijk in de expressie van het transgen in reactie op verschillende plaats van integratie van hetzelfde. Bijvoorbeeld de eerste muizen die het transgen voor het groeihormoon tot expressie toonde afmetingen van het lichaam verdubbeld in vergelijking met het wild type muizen; de onderzoekers geconcludeerd dat de hoeveelheid cDNA geïntroduceerd onder de controle van de induceerbare promotor van het gen voor metallothioneïne, was overdreven en ongereguleerde. Voor deze moet je extra regulatoire gebieden specifiek voor het gen in kwestie te voeren.

Applicatie Voorbeelden

Transgenese in de manipulatie van plantaardige organismen

De planten vormen een belangrijke bron voor de productie van recombinante eiwitten, omdat daarvoor lage kosten worden gekweekt, de overgang van het laboratorium naar de toepassing op grote schaal is relatief eenvoudig en ook het potentieel gevaar voor besmetting met virale middelen zijn vrij verminderd. Plantencellen hebben ook routes van post-translationele modificatie vergelijkbaar met die dieren, maar onderscheiden zich door kleine variaties in de straten van glycosylering. Het gebruik ervan voor de productie van recombinante humane eiwitten worden toegewezen aan het therapeutisch gebruik is dus een gevolg van groot belang. Tot de belangrijkste waren de humane groeihormoon, geproduceerd als een fusie-eiwit met de Agrobacterium nopaline synthase in transgene tabak en zonnebloem. Dit was mogelijk door gebruik het intrinsieke vermogen van Agrobacterium aan de planten door de overdracht en de daaropvolgende integratie infecteren in het chromosomale DNA van een gebied van het Ti-plasmide. Momenteel de tabak ondanks dat het vaakst gebruikt voor dit type onderzoek eetbare planten zoals rijst winnen grote belangstelling van onderzoekers ze direct worden geconsumeerd zonder dat het recombinant eiwit te zuiveren. Een klassiek voorbeeld van transgenese geïnteresseerd zijn eigen productie van genetisch gemodificeerde rijst. De wilde rijst produceert geen vitamine A. De eerste stap is het extraheren van een andere inrichting, het gen dat codeert voor het vitamine; dan zal deze laatste worden ingebracht in het genoom van de wilde rijst die vitamine geproduceerd. Aangezien deze graansoort grotendeels verbruikt in de East, zou het realiseren van een rijst producent van vitamine A voorkomen van ernstige aandoeningen, zoals blindheid, in verband met het ontbreken van de genoemde vitamine.

Transgenese in het manipuleren van embryonale cellen

Een Transgenese toegepast op de manipulatie van embryonale cellen omvat de introductie van vreemd DNA in totipotente cellen voornoemde. Deze cellen worden genomen binnen het blastocyst. Het vreemde DNA wordt in ES-cellen met behulp van verschillende technieken worden de getransfecteerde cellen vervolgens opnieuw in een blastocyst en opnieuw geïmplanteerd in een donna.Con deze techniek zuigelingen chimeren, sommige met genetica`s materiaal terwijl anderen genetisch gemodificeerd. Aangezien in 1982 in het laboratorium het eerste geval van een transgene muis werd bereikt, vandaag de productie van transgene dieren stijgt elke dag, kan worden gemanipuleerd, en humane embryonale cellen ook die van varkens, koeien, konijnen en schapen. De techniek wordt hoofdzakelijk door micro-injectie uitgevoerd en komt als volgt: in de eerste fase is een groot aantal bevruchte eitjes te isoleren; Deze worden verkregen door vrouwtjes hormonale behandeling om superovulatie te induceren; in de tweede fase worden de zygoten behandeld een voor een met een micropipet is de introductie van een oplossing die exogeen DNA; in de derde fase worden deze eieren geïmplanteerd in de vrouwelijke geslachtsorganen door het controleren van de tijd dat de dracht vlot verlopen. Aan het einde van de zwangerschap na spenen baby, controleer of er integratie van het transgen is.

Transgenese metafase II

In de eerste jaren van dit decennium het is een nieuwe technologie ontwikkeld die het mogelijk maakt om zelfs de hele chromosomen in te voeren. Deze nieuwe techniek gaat juist onder de naam metafase II transgenese. De praktijk impliceert het nemen van een cavia DNA-fragmenten of hele chromosomen en meng ze met sperma volwassen. De zaadcellen worden vooraf behandeld met detergenten of onderworpen aan cycli van invriezen en ontdooien, aangezien dit lijkt het succes van het experiment te verbeteren. Op dit moment het geheel in een oöcyt wordt ingebracht in metafase II, in een bepaalde fase van de celcyclus, door een micro-injectie die de cel binnenkomt en geeft zijn inhoud.

Transgene dieren

Genetisch vee en andere huisdieren met betrekking tot eigenschappen zoals melkgift, de eigenschappen van wol, het percentage van aankoop, het gewicht, de frequentie van paai verbeteren, vereist verschillende generaties selectieve koppelingen. Voor elke volgende generatie worden gebruikt als fokdieren superieure eigenschappen en, aan het einde, wordt u verkregen als reproductieve lijnen meer of minder zuiver dieren de hoge productiekosten. Tot niet zo lang geleden selectief fokken was de enige manier om de genetische kenmerken van de dieren te verbeteren. Het vermogen om genen over te dragen in zoogdiercellen en creëren van genetisch identieke dieren een door transplanteren van de nuclei van embryonale weefsel in eieren ontnomen oorspronkelijke kern leidde het onderzoek op de plaats van plaatsing in het chromosomale DNA van hogere organismen individuele genen of gen functionele aggregaten . Het definieert een transgeen dier waarvan genetische opmaak is gewijzigd door de toevoeging van vreemd DNA.

  • Transgeen vee

Voor de creatie van deze dieren als onderzoekers ging eerst naar de eicellen die zijn gerijpt in vitro en vervolgens, altijd in vitro waren bevrucht met het sperma van stieren te verzamelen. Door centrifugeren werden ook op de mannelijke pronuclei waarin, door micro-injectie van DNA werd toegevoegd. Het embryo werd ontwikkelen in vitro het blastocyst stadium; Op dit punt maakt de plant voorkomt in een pleegmoeder en postpartum screening werd uitgevoerd op het nageslacht te zien in welke hoeveelheid het transgen aanwezig was. De resultaten van deze studies zijn onbevredigend omdat vanaf 2460 oöcyten werden verkregen twee kalveren die het transgen bevatten. Door middel van transgenese u kan worden gegenereerd melkkoeien die melk produceren met verschillende samenstelling. De hoeveelheid kaas verkrijgbaar uit melk caseïne evenredig is met K door verhoging caseïne K overexpressie van het gen logisch te denken om in staat om de hoeveelheid kaas verkrijgbaar verhogen. De expressie van het transgen van lactase in de melkklier bovendien zou leiden tot de productie van lactosevrije melk, uitstekend voor de mensen die ervaring intolerantie voor lactose. Voor runderen meestal kunt u de creatie van de dieren krijgen met resistentie tegen bacteriële, virale en parasitaire. Momenteel ziekten van dit type worden gecontroleerd door vaccinatie en medicatie. Er zijn plannen om een ​​beschermende immuunrespons erfelijke bereikt door transgenese bieden. De techniek bestaat uit het introduceren van transgenen van een antilichaam aangepast om een ​​specifiek antigeen binden.

Bovendien, onlangs in China werden we experimenten uitgevoerd op transgene koe kan produceren de moedermelk en rijk aan eiwitten. Dit was mogelijk dankzij de introductie van menselijke genen in ongeveer driehonderd runderen die zijn begonnen met het verstrekken van een rijke melk lysozym en lactoferrine. Het onderzoeksteam, dat het onderzoek, gepubliceerd in de Public Library of Science One uitgevoerd, ze zijn er zeker van dat de door koemelk veilig is, omdat het is zeer vergelijkbaar, zo niet identiek aan dat geproduceerd door vrouwen net moeders geworden. In Groot-Brittannië, maar Helen Wallace, van GeneWatch gezegd dat je niet zeker kan zijn dat deze melk is veilig voor mens en om deze reden dat we testen moeten doen op een grote schaal.


  • Transgene muizen

Transgene technologie is ontwikkeld en geperfectioneerd het experiment rat. Sinds 1980 werden ze geschapen verschillende stammen van transgene muizen voor honderden verschillende genen. Ten behoeve van transgenese DNA wordt ingebracht in muizen drie manieren: 1) retrovirale vectoren die het embryo in de vroege stadia van het leven te infecteren voor implantatie in een receptief vrouwtje; 2) micro-injectie in de mannelijke pronucleus van een bevruchte eicel; 3) introductie van genetisch gemanipuleerde totipotente stamcellen in het embryo in de vroege stadia van ontwikkeling. De muizen zijn geschikt voor gebruik als modelsystemen voor zowel sommige ziekten van de mens is om potentiële therapeutische middelen te testen. Tot de genetische ziekten meest bestudeerde van deze muizen worden genoemd: de ziekte van Alzheimer, artritis, spierdystrofie, hypertensie, neurodegeneratieve aandoeningen en endocriene stoornissen.

Ziekte van Alzheimer treft ongeveer 1% van de bevolking 60-65 jaar. Deze aandoening heeft alleen invloed op de US ongeveer 4 miljoen mensen en kost ongeveer $ 100.000.000.000. In hersencellen van deze onderwerpen in de cellichamen, zij accumuleren van neurofibrillaire tangles, bij synapsen dichte extracellulaire aggregaten genoemd seniele plaques en ter hoogte van de hersenvaten zijn waargenomen aggregaten genaamd amyloïde organen. Beide seniele plaques amieloidi dat de organen worden gevormd door een eiwit genaamd Aß dat is afgeleid van de proteolytische splitsing van het β amyloïd precursor protein, APP. Werden gegenereerd transgene muizen bezitten verschillende versies van het gen PPV en neurodegeneratie vergelijkbaar met de ziekte werd bereikt met een transgen bestaande uit de codificatie gebied van de laatste 100 aminozuren van APP, waarvan de Abeta eiwitsequentie bevat. Op deze wijze was het mogelijk om een ​​diermodel fundamentele vragen over de moleculaire basis van deze ziekte beantwoorden verkrijgen.

Bij cystische fibrose muizen werden ze ontworpen om het product scheiden in de melk van het cystische fibrose transmembraan regulator eiwit. Dit eiwit is betrokken bij de regulering van de chloridekanalen en de verandering veroorzaakt de ophoping van slijm in verschillende organen met ernstige respiratoire gevolgen die leiden tot de dood. De expressiesystemen in vitro resultaten niet efficiënt als zodanig proteïne accumuleert in het membraan van de getransfecteerde cellen en hun metabolisme verandert; In plaats van de cellen van de borstklier in vetbolletjes omvatten een deel van het membraan en aangezien deze cellen worden uitgescheiden in de melk de uier wordt niet beïnvloed door de accumulatie van CFTR. Vanuit het oogpunt van de aanvraag werd gekloneerd van een cDNA-sequentie van CFTR binnenkant van een defect gen voor β caseïne tussen exon 2 en 7, ook voor de transcriptie van het transgen werden behouden promotersequenties en van bevorderen stoppen β caseïne. Melk van transgene vrouwtjes die het CFTR in het membraan van de vetbolletjes zonder dat dieren riportassero bijwerkingen. Dergelijk onderzoek is uitgevoerd op geiten, maar, gezien de uitstekende resultaten die hij breidt het onderzoek ook van koeien en schapen.

Transgene dieren: modellen van menselijke ziekten

Jarenlang zoogdieren zijn gebruikt voor het onderzoek van menselijke ziekten, zowel de pathogenetische mechanismen die de mogelijke werkzaamheid van innovatieve therapieën die het mogelijk maken te voeren klinische proeven. Maar vóór de komst van technieken voor het maken van transgene dieren, dieren vinden dat het model van genetische ziekten te vertegenwoordigen, en dus geërfd, was het zeer moeilijk, zo niet onmogelijk. Vandaag Dankzij genmanipulatie, evenals de recombinant DNA-techniek, kun diermodel voor verschillende pathologieën te maken. Een van de eerste modellen herinneren muizen met bijzondere aanleg voor kanker, waarin zij zijn opgenomen proto-oncogenen exogene. Bij meer complexe ziekten, eigentijdse veroorzaakt door de werking van meerdere genen, de zogenaamde "multifactoriële ziekten", het creëren van geschikte transgene modellen zeer problematisch. Desondanks resulteert stimulantia werden verkregen door het kruisen van verschillende stammen van transgene muizen. Een voorbeeld is de koppeling tussen muizen "gegolfd" Patch en dat nageslacht de menselijke geboorteafwijking spina bifida occulte genereert.


  • Schapen, geiten en varkens transgene

Het was mogelijk om de productie van transgene schapen wol het verhogen van de groei van het vlies door overexpressie van een construct dat bestaat uit een muizen promoter van keratine verbeteren. Verder transgenese aangebracht op schapen en geiten is gericht op de ontwikkeling van de melkklieren als bioreactoren voor de productie van eiwitten van farmaceutisch gebruik. In deze dierlijke transgenese heeft deze geen negatieve effecten op zowel de moeder of het kind nakomelingen gehad. De introductie van het transgen in het varken bovine groeihormoon, maar heeft u tot een groter vermogen om voedsel te zetten in lichaamsgewicht, maar ook bij pathologische aandoeningen zoals maagzweren, de nieren disfuncties, overgave, de "cardiale inflammatie. Positieve resultaten werden verkregen in de productie van menselijke hemoglobine gemodificeerd met gebruik van een construct omvattende een regulerend gebied van het gen van het humane β globine gewricht met twee globine genen a1 en menselijke globine gen PA-humane transgene varkens. De belemmering voor de transplantatie van organen van de ene soort naar de andere is hyperacute afwijzing. Huisdieren zijn een waardevolle bron van organen voor transplantatie, maar de aanwezigheid van reeds bestaande antilichamen in het gastheerorganisme dat bindt aan een epitoop op het oppervlak van cellen geïmplanteerd orgaan, waardoor een ontstekingsreactie die leidt tot verlies enten. Onder natuurlijke omstandigheden de oppervlakte-eiwitten van de epitheelcellen van de bloedvaten om cellen te beschermen tegen de ontstekingsreactie. Als het donordier recasse voor humane eiwitten remmers zijn van complement zou een transplantaat worden beschermd door de ontstekingsreactie. Daarom transgene varkens geproduceerd in het bezit van genen remmers van complement. De transplantatie van organen bij primaten behoren tot deze transgene varkens zag een lichte vertraging in het orgel afwijzing.

  • Transgene kippen

Deze organen dienen om de niveaus van vet en cholesterol in eieren te verlagen en de kwaliteit van het vlees. U kunt de kippen resistent tegen virusziekten verkrijgen en wordt ook verondersteld de mogelijkheid om uit het ei eiwit geneesmiddelen die zou accumuleren in het album of het ei.

  • Transgene vis

Vanwege de uitputting van de visserij, zal deze voedselbron meer en meer op de aquacultuur worden gebaseerd. de genetische verandering van de vis wordt een fundamentele doelstelling van het onderzoek. Tot nu toe werden zij geïntroduceerd transgenen in een aantal soorten, karper, meerval, forel, zalm. De ontwikkeling van vis eieren vindt plaats buiten zodat het niet nodig om de plant maar de ontwikkeling kan in thermisch gecontroleerde tanks. het percentage vis embryo's die overleeft na microinjectie van DNA met een hoge productie van transgene vis die varieert van 10 tot 70%. Vele studies hebben zich geconcentreerd op het effect van het transgen van groeihormoon op de groeisnelheid. Werd geïnjecteerd in de eieren van Atlantische zalm een ​​transgen onder de controle van de promoter van het gen van het antivriesproteïne zee aal. De zalm waren groter en groeide snel. Zij werden vervolgens gemicroinjecteerd eieren van de zalm van de Noord-Amerikaanse Pacific Coast en ga naar een jaar solmoni transgene waren 11 keer zwaarder dan niet-transgene.

(0)
(0)
Commentaren - 0
Geen reacties

Voeg een Commentaar

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Tekens over: 3000
captcha